Restriktioendonukleaasit ovat luokka entsyymi jotka leikkaavat DNA-molekyylejä. Jokainen entsyymi tunnistaa ainutlaatuiset nukleotidisekvenssit DNA-juosteessa - yleensä noin neljästä kuuteen emäsparia pitkä. Sekvenssit ovat palindromisia siinä mielessä, että komplementaarisella DNA-juosteella on sama sekvenssi käänteisessä suunnassa. Toisin sanoen, molemmat DNA-juosteet leikataan samaan kohtaan.
Mistä näitä entsyymejä löytyy
Restriktioentsyymejä löytyy monista bakteerikannoista, joissa niiden biologisena tehtävänä on osallistua solujen puolustukseen. Nämä entsyymit rajoittavat vieraita (virus) DNA: ta, jotka pääsevät soluihin tuhoamalla ne. Isäntäsoluissa on restriktiomodifikaatiojärjestelmä, joka metyloi omaa DNA: ta kohdille, jotka ovat spesifisiä vastaaville restriktioentsyymeilleen, suojaten siten niitä pilkkoutumiselta. Yli 800 tunnetut entsyymit on löydetty tunnistamaan yli 100 erilaista nukleotidisekvenssiä.
Rajoittavien entsyymien tyypit
Restriktioentsyymejä on viittä erityyppistä. Tyyppi I leikkaa DNA: n satunnaisissa paikoissa jopa 1 000 tai enemmän emäsparia tunnistuskohdasta. Tyyppi III leikkaa noin 25 emäsparia kohdasta. Molemmat näistä tyypeistä vaativat ATP: tä ja voivat olla suuria entsyymejä, joilla on useita alayksiköitä. Tyypin II entsyymit, joita käytetään pääasiassa biotekniikassa, leikkaavat DNA: n tunnetussa sekvenssissä ilman ATP: tä ja ovat pienempiä ja yksinkertaisempia.
Tyypin II restriktioentsyymit nimetään niiden bakteerilajien mukaan, joista ne eristetään. Esimerkiksi EcoRI-entsyymi eristettiin E. coli. Suurin osa yleisöstä tuntee E: n. coli -epidemiat ruuassa.
Tyypin II restriktioentsyymit voivat tuottaa kahta erityyppistä leikkausta riippuen siitä, leikkaavatko ne molemmat juosteet tunnistussekvenssin keskellä tai jokainen juoste lähempänä tunnistuksen toista päätä sekvenssi.
Aikaisempi leikkaus tuottaa "tylpät päät" ilman nukleotidien ulokkeita. Jälkimmäinen muodostaa "tahmeita" tai "yhtenäisiä" päitä, koska jokaisella tuloksena olevalla DNA-fragmentilla on ylitys, joka täydentää muita fragmentteja. Molemmat ovat käyttökelpoisia molekyyligenetiikassa valmistukseen rekombinantti-DNA ja proteiinit. Tämä DNA-muoto erottuu, koska se tuotetaan ligoimalla (sitoutumalla yhteen) kahdesta tai useammasta eri juosteesta, joita ei alun perin ollut linkitetty toisiinsa.
Tyypin IV entsyymit tunnistavat metyloidun DNA: n, ja tyypin V entsyymit käyttävät RNA: ta leikkaamaan sekvenssejä tunkeutuvista organismeista, jotka eivät ole palindromisia.
Käyttö biotekniikassa
Restriktioentsyymejä käytetään biotekniikassa DNA: n leikkaamiseen pienempiin juosteisiin fragmenttien pituuserojen tutkimiseksi yksilöiden välillä. Tätä kutsutaan restriktiofragmenttien pituuden polymorfismiksi (RFLP). Niitä käytetään myös geenikloonaukseen.
RFLP-tekniikat Niitä on käytetty määrittämään, että yksilöillä tai yksilöryhmillä on selvät erot geenisekvensseissä ja restriktiohajotuskuvioissa tietyillä genomialueilla. Näiden ainutlaatuisten alueiden tuntemus on perusta DNA-sormenjäljet. Jokainen näistä menetelmistä riippuu agaroosigeelielektroforeesi DNA-fragmenttien erottamiseksi. TBE-puskuria, joka koostuu Tris-emäksestä, boorihaposta ja EDTA: sta, käytetään yleisesti agaroosigeelissä elektroforeesi tutkia DNA-tuotteita.
Käyttö kloonauksessa
Kloonaus vaatii usein geenin insertoinnin plasmidiin, joka on DNA-kappaleen tyyppi. Rajoittavat entsyymit voivat auttaa prosessia, koska yksisäikeiset ulkonemat jättävät leikkauksia tekeessään. DNA-ligaasi, erillinen entsyymi, voi yhdistää kaksi DNA-molekyyliä, joilla on vastaavat päät.
Joten käyttämällä restriktioentsyymejä DNA-ligaasientsyymien kanssa, eri lähteistä saatuja DNA-paloja voidaan käyttää yhden DNA-molekyylin luomiseen.