Kenttä biotekniikka on jatkuva muutos. Huippututkimuksen nopea kasvu ja kehitys ovat riippuvaisia innovaatioista ja luovuudesta tutkijat ja heidän kykynsä nähdä potentiaali molekyylin perustekniikassa ja soveltaa sitä uuteen prosessit. Polymeraasiketjureaktion tulo (PCR-) avasi monia ovia geenitutkimukseen, mukaan lukien keinot DNA-analyysi ja erilaisten geenien tunnistaminen niiden DNA-sekvenssien perusteella. DNA-sekvensointi riippuu myös kyvystämme käyttää geelielektroforeesi erottaa DNA-juosteet, jotka eroavat kooltaan vain yhdellä emäsparilla.
DNA-sekvensointi
1970-luvun lopulla keksittiin kaksi DNA-sekvensointitekniikkaa pidemmille DNA-molekyyleille: Sanger (tai dideoksi) menetelmä ja Maxam-Gilbert (kemiallinen pilkkominen) menetelmä. Maxam-Gilbert-menetelmä perustuu nukleotidispesifiseen pilkkoutumiseen kemikaalien avulla ja sitä käytetään parhaiten oligonukleotidien sekvensointiin (lyhyet nukleotidipolymeerit, yleensä alle 50 emäsparia). Sanger-menetelmää käytetään yleisemmin, koska sen on osoittautunut teknisesti helpommaksi soveltaa, ja yhdessä PCR: n tulo ja tekniikan automatisointi, voidaan helposti soveltaa pitkiin DNA-juosteisiin, mukaan lukien jotkut kokonaiset geenejä. Tämä tekniikka perustuu ketjun lopettamiseen dideoksinukleotidien avulla PCR-pidentymisreaktioiden aikana.
Sanger-menetelmä
Sanger-menetelmässä analysoitavaa DNA-juostetta käytetään templaattina ja DNA-polymeraasia käytetään PCR-reaktiossa komplementaaristen juosteiden tuottamiseksi käyttämällä alukkeita. Valmistetaan neljä erilaista PCR-reaktioseosta, joista kukin sisältää tietyn prosenttisesti dideoksinukleosiditrifosfaatti (ddNTP) -analogeja yhdeksi neljästä nukleotidistä (ATP, CTP, GTP tai TTP).
Uuden DNA-juosteen synteesi jatkuu, kunnes yksi näistä analogeista sisällytetään, jolloin juoste katkaistaan ennenaikaisesti. Jokainen PCR-reaktio lopulta sisältää seoksen eripituisia DNA-juosteita, jotka kaikki päättyvät nukleotidiin, joka oli dideoksileimattu tätä reaktiota varten. Geeli elektroforeesi Sitten käytetään erottamaan neljän reaktion juosteet neljässä erillisessä kaistassa ja määrittämään alkuperäisen templaatin sekvenssi sen perusteella, mitkä juosten pituudet päättyvät millä nukleotidilla.
Automatisoidussa Sanger-reaktiossa käytetään alukkeita, jotka on merkitty neljällä eri värillisellä fluoresoivalla leimalla. PCR-reaktiot, erilaisten dideoksinukleotidien läsnä ollessa, suoritetaan kuten yllä on kuvattu. Seuraavaksi kuitenkin neljä reaktioseosta yhdistetään ja levitetään yhdelle geelikaistalle. Kunkin fragmentin väri havaitaan lasersäteellä ja tieto kerätään tietokoneella joka tuottaa kromatogrammit, jotka osoittavat piikit jokaiselle värille, mistä templaatti-DNA-sekvenssi voi olla määritetty.
Tyypillisesti automatisoitu sekvensointimenetelmä on tarkka vain sekvensseille, joiden pituus on korkeintaan noin 700-800 emäsparia. Kuitenkin on mahdollista saada suurempien geenien täydelliset sekvenssit ja itse asiassa kokonaiset genomit käyttämällä vaiheittaisia menetelmiä, kuten Primer Walking- ja Shotgun-sekvensointia.
Primer-kävelyssä sekvensoidaan toimiva osa suuremmasta geenistä käyttämällä Sanger-menetelmää. Uusia alukkeita muodostetaan sekvenssin luotettavasta segmentistä ja niitä käytetään sekvensoimaan edelleen geenin osa, joka oli alkuperäisten reaktioiden rajojen ulkopuolella.
Haulikkojen sekvensointi tarkoittaa mielenkiinnon kohteena olevan DNA-segmentin leikkaamista tarkoituksenmukaisemmaksi (hallittavissa) kokoiset fragmentit, sekvensoimalla kukin fragmentti ja järjestämällä kappaleet päällekkäisyyksien perusteella sekvenssit. Tätä tekniikkaa on helpottanut soveltamalla tietokoneohjelmia päällekkäisten kappaleiden järjestämiseen.