Gram-värjäysmenetelmä mikrobiologiassa

Gram-värjäys on differentiaalinen värjäysmenetelmä, jota käytetään osoittamaan bakteerit yhdelle kahdesta ryhmästä (gram-positiivinen ja gram-negatiivinen) perustuen heidän soluseinänsä. Se tunnetaan myös nimellä Gram-värjäys tai Gram-menetelmä. Menettely on nimetty tekniikan kehittäneelle henkilölle, tanskalaiselle bakteriologille Hans Christian Gramille.

Menettely perustuu peptidoglykaanin väliseen reaktioon joidenkin bakteerien soluseinämissä. Gram-värjäykseen sisältyy bakteerien värjäys, värin kiinnittäminen peiteaineella, solujen värin poistaminen ja maalivärin levitys.

1. Ensisijainen tahra (kristalli violetti) sitoutuu peptidoglykaaniin, värjäämällä solut violetiksi. Sekä gram-positiivisissa että gram-negatiivisissa soluissa on peptidoglykaania soluseinämissä, joten aluksi kaikki bakteerit värjäävät violetti.
2. Gram-jodi (jodi ja kaliumjodidi) lisätään peitteenä tai kiinnitysaineena. Gram-positiiviset solut muodostavat kidevioletti-jodikompleksin.
3. alkoholi tai asetonia käytetään solujen värin poistamiseen. Gramnegatiivisissa bakteereissa on paljon vähemmän peptidoglykaania soluseinämissä, joten tämä vaihe tekee niistä olennaisesti värittömiä, samalla kun vain osa väristä poistetaan gram-positiivisista soluista, joissa on enemmän peptidoglykaania (60-90% soluseinämästä). Gram-positiivisten solujen paksu soluseinä dehydratoidaan värivaihto-vaiheella, aiheuttaen niiden kutistumisen ja tarttumisen värjäytyneeseen jodikompleksiin sisällä.
   instagram viewer
4. Värjäysvaiheen jälkeen levitetään vastavärjäys (yleensä safraniini, mutta joskus fuksiini) bakteerien värjämiseksi vaaleanpunaiseksi. Sekä gram-positiiviset että gram-negatiiviset bakteerit ottavat vaaleanpunaisen värjäyksen, mutta sitä ei ole näkyvissä gram-positiivisten bakteerien tummemman violetin päällä. Jos värjäys suoritetaan oikein, gram-positiiviset bakteerit ovat purppuraisia, kun taas gram-negatiiviset bakteerit ovat vaaleanpunaisia.

Gram-värjäyksen tulokset tarkastellaan käyttäen valomikroskopiaa. Koska bakteerit ovat värillisiä, ei vain niiden gram-värjäysryhmä tunnisteta, vaan heidän muodonsa, koko ja rypistymiskuvio voidaan havaita. Tämä tekee Gram-värjäyksestä arvokkaan diagnoosityökalun lääkäriasemaan tai laboratorioon. Vaikka tahra ei välttämättä tunnista bakteereja, riittää usein tietäminen, ovatko ne gram-positiivisia vai gram-negatiivisia, tehokkaan antibiootin määräämiseen.

Jotkut bakteerit voivat olla gram-muuttuvia tai grammaa määrittelemättömiä. Jopa nämä tiedot voivat kuitenkin olla hyödyllisiä kaventamalla bakteerien identiteettiä. Tekniikka on luotettavin, kun viljelmät ovat alle 24 tuntia vanhoja. Vaikka sitä voidaan käyttää liemiviljelmissä, on parasta sentrifugoida ne ensin. Tekniikan ensisijainen rajoitus on, että se tuottaa virheellisiä tuloksia, jos tekniikkaan tehdään virheitä. Luotettavan tuloksen saamiseksi tarvitaan käytäntöä ja taitoa. Tartunta-aine ei myöskään voi olla bakteeri. Eukaryoottiset patogeenit värjäävät gram-negatiivisina. Kuitenkin useimmat eukaryoottisolut paitsi sienet (mukaan lukien hiiva) eivät pysy kiinni objektilasissa prosessin aikana.

• Kristalli violetti (ensisijainen tahra)
• Gramin jodi (peiteaine, kristallivioletin kiinnittämiseksi soluseinämään)
• Etanoli tai asetoni (värinpoistoaine)
• Safraniini (toissijainen tahra tai maalausmaali)
• Vesi ruiskupullossa tai tiputinpullossa
• Mikroskooppi dioja
• Yhdistelmämikroskooppi

1. Aseta pieni tippa bakteerinäytettä objektilasille. Lämpö kiinnitetään bakteereihin objektilasille johtamalla se Bunsen-polttimen liekin läpi kolme kertaa. Liian suuren lämmön tai liian pitkään käyttäminen voi sulattaa bakteerisolujen seinät, vääristää niiden muotoa ja johtaa virheelliseen tulokseen. Jos lämpöä käytetään liian vähän, bakteerit pesevät objektilasin värjäämisen aikana.
2. Levitä ensisijainen tahra (kristalli violetti) liuskalle tiputtajan avulla ja anna sen istua minuutin ajan. Huuhtele objektilasi varovasti vedellä enintään 5 sekunnin ajan ylimääräisen tahran poistamiseksi. Liian pitkä huuhtelu voi poistaa liikaa väriä, kun taas huuhtelematta tarpeeksi kauan, liiallinen tahra voi jäädä gramnegatiivisiin soluihin.
3. Levitä tiputtajalla Gram-jodia objektilasille kiinnittääksesi kidevioletin soluseinämään. Anna sen istua minuutin.
4. Huuhtele objektilasi alkoholilla tai asetonilla noin 3 sekuntia, sen jälkeen huuhtele heti vedellä kevyesti. Gramnegatiiviset solut menettävät värin, kun taas gram-positiiviset solut pysyvät violetteina tai sinisinä. Jos värinpoistolaitetta jätetään kuitenkin liian kauan, kaikki solut menettävät värin!
5. Levitä toissijainen tahra, safraniini ja anna sen istua minuutin ajan. Huuhtele varovasti vedellä enintään 5 sekunnin ajan. Gramnegatiivisten solujen tulisi olla värjätty punaisiksi tai vaaleanpunaisiksi, kun taas gram-positiiviset solut näyttävät silti violetti tai sininen.
6. Katso objektilasi mikroskoopilla. Solun muodon ja järjestelyn erottamiseksi voidaan tarvita suurennus 500x1000x.

Kaikkiin Gram-värjäyksellä tunnistettuihin bakteereihin ei liity tauteja, mutta muutamaan tärkeään esimerkkiin sisältyy:

• Gram-positiiviset kokit (pyöreä):Staphylococcus aureus
• Gramnegatiiviset kokit:Neisseria meningitidis
• Gram-positiiviset baciilit (tangot): Bacillus anthracis
• Gramnegatiiviset baciilit:Escherichia coli