DNA: n monistus polymeraasiketjureaktion avulla

PCR- tarkoittaa polymeraasiketjureaktio, molekyylibiologinen tekniikka DNA-segmenttien monistamiseksi, generoimalla useita kopioita käyttämällä DNA-polymeraasientsyymejä kontrolloiduissa olosuhteissa. Vain yksi DNA-segmentin tai geenin kopio voidaan kloonata miljooniin kopioihin, mikä mahdollistaa havaitsemisen väriaineilla ja muilla visualisointitekniikoilla.

Vuonna 1983 kehitetty PCR-prosessi on mahdollistanut suorittamisen DNA-sekvensointi ja tunnistaa nukleotidien järjestys yksittäisissä geeneissä. Menetelmässä käytetään lämpösykliä tai reaktion toistuvaa kuumentamista ja jäähdyttämistä DNA: n sulamiseen ja replikaatioon. Kun PCR jatkuu, ”uutta” DNA: ta käytetään templaattina replikaatioon ja tapahtuu ketjureaktio, monistaen eksponentiaalisesti DNA-templaatin.

PCR-tekniikoita käytetään monilla biotekniikan aloilla, mukaan lukien proteiinitekniikka, kloonaus, oikeuslääketiede (DNA-sormenjäljet), isyystestaus, perinnöllisten ja / tai tarttuvien tautien diagnosointi ja analyysi Ympäristönäytteistä.

Erityisesti oikeuslääketieteessä PCR on erityisen hyödyllinen, koska se monistaa pienimmänkin määrän DNA-todisteita. PCR: ää voidaan käyttää myös tuhansien vuosien vanhan DNA: n analysointiin, ja näitä tekniikoita on käytetty kaiken tunnistamiseen 800 000-vuotiaasta mammutista muumioihin ympäri maailmaa.

Tämä vaihe on tarpeen vain DNA-polymeraaseille, jotka vaativat kuumakäynnistyksen PCR: ää. Reaktio kuumennetaan lämpötilaan 94 - 96 ° C ja pidetään 1-9 minuutin ajan.

Jos menettely ei vaadi alustamista, denaturointi on ensimmäinen askel. Reaktio kuumennetaan 94 - 98 ° C: seen 20-30 sekunniksi. DNA-templaatin vety sidokset hajoavat ja yksijuosteiset DNA-molekyylit luodaan.

Reaktiolämpötila on alempi välillä 50 - 65 ° C ja pidetään 20-40 sekuntia. Alukkeet hehkuttavat yksijuosteista DNA-templaattia. Lämpötila on erittäin tärkeä tämän vaiheen aikana. Jos se on liian kuuma, pohjamaali ei ehkä sitoudu. Jos se on liian kylmä, pohjamaali saattaa sitoutua epätäydellisesti. Hyvä sidos muodostuu, kun alukesekvenssi vastaa läheisesti templaattisekvenssiä.

Lämpötila tämän vaiheen aikana vaihtelee polymeraasin tyypistä riippuen. DNA-polymeraasi syntetisoi täysin uuden DNA-juosteen.

Tämä vaihe suoritetaan lämpötilassa 70 - 74 ° C 5-15 minuutin ajan viimeisen PCR-syklin jälkeen.

Tämä vaihe on valinnainen. Lämpötila pidetään 4-15 ° C: ssa ja se reagoi.

Jokaisen syklin aikana tuote (spesifinen DNA-pala, joka replikoituu) kaksinkertaistuu.

Kun DNA-polymeraasi menettää aktiivisuuden ja kuluttaa reagensseja, reaktio hidastuu.

Enemmän tuotetta ei kerry.