Kuinka polymeraasiketjureaktio toimii geenien vahvistamiseksi

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on molekyyligeneettinen tekniikka useiden kopioiden tekemiseen geenistä, ja se on myös osa geenien sekvensointiprosessia.

Geenikopiot tehdään DNA-näytteestä, ja tekniikka on riittävän hyvä tekemään useita kopioita yhdestä näytteessä olevan geenin kopiosta. Geenin PCR-monistaminen miljoonien kopioiden tekemiseksi mahdollistaa geenisekvenssien havaitsemisen ja tunnistamisen visuaalisilla tekniikoilla, jotka perustuvat DNA-palan kokoon ja varaukseen (+ tai -).

Kontrolloiduissa olosuhteissa entsyymit, jotka tunnetaan nimellä DNA-polymeraasit, tuottavat pieniä DNA-segmenttejä, jotka lisäävät ilmaisia ​​deoksinukleotideja. (dNTP: t) DNA-palalle, joka tunnetaan nimellä "templaatti". Jopa pienempiä DNA: n paloja, joita kutsutaan "alukkeiksi", käytetään lähtökohtana polymeraasi.

Alukkeet ovat pieniä ihmisen tekemiä DNA-kappaleita (oligomeereja), jotka ovat yleensä 15-30 nukleotidiä pitkiä. Ne tehdään tietämällä tai arvaamalla lyhyitä DNA-sekvenssejä monistettavan geenin päissä. PCR: n aikana sekvensoitavaa DNA: ta kuumennetaan ja kaksoisjuosteet erottuvat. Jäähtyessään alukkeet sitoutuvat malliin (kutsutaan hehkutukseksi) ja luovat paikan polymeraasin alkamiselle.

Polymeraasiketjureaktion (PCR) teki mahdolliseksi termofiilien ja termofiilisten aineiden löytäminen polymeraasientsyymit (entsyymit, jotka säilyttävät rakenteellisen eheyden ja toiminnallisuuden korkealla kuumennuksella lämpötilat). PCR-tekniikan vaiheet ovat seuraavat:

• Luodaan seos, jossa on optimoidut pitoisuudet DNA-templaattia, polymeraasientsyymiä, alukkeita ja dNTP: itä. Kyky lämmittää seos denaturoimatta entsyymiä mahdollistaa DNA-näytteen kaksoiskierteen denaturoinnin 94 asteen lämpötiloissa Celsius.
• Denaturoinnin jälkeen näyte jäähdytetään maltillisemmalle alueelle, noin 54 asteeseen, mikä helpottaa alukkeiden pariutumista (sitoutumista) yksijuosteisiin DNA-templaatteihin.
• Syklin kolmannessa vaiheessa näyte lämmitetään uudelleen 72 asteeseen, joka on ihanteellinen lämpötila Taq DNA Polymerase -tuotteelle pidennystä varten. Pidennyksen aikana DNA-polymeraasi käyttää alkuperäistä DNA-juostetta templaattina komplementaaristen dNTP: iden lisäämiseksi kunkin alukkeen 3'-päihin ja muodostaa osan kaksijuosteista DNA: ta kiinnostavan geenin alueelle.
• Alukkeet, jotka ovat pariutuneet DNA-sekvensseihin, jotka eivät täsmää täsmällisesti, eivät pysy pariutuneina 72 asteessa, mikä rajoittaa kiinnostuksen kohteena olevan geenin pidentymistä.

Tämä denaturointi-, pariutumis- ja elongaatioprosessi toistetaan useita (30-40) kertaa, mikä lisää eksponentiaalisesti halutun geenin kopioiden määrää seoksessa. Vaikka tämä prosessi olisi melko työläs, jos se suoritetaan manuaalisesti, näytteet voidaan valmistaa ja inkuboida a ohjelmoitava Thermocycler, joka on nykyään yleinen useimmissa molekyylilaboratorioissa, ja täydellinen PCR-reaktio voidaan suorittaa 3-4 tuntia.

Jokainen denaturointivaihe pysäyttää edellisen syklin pidentymisprosessin, lyhentäen siten uuden DNA-juosteen ja pitäen sen suunnilleen halutun geenin kokoisena. Pidentymissyklin kestoa voidaan pidentää tai lyhentää kiinnostuksen kohteena olevan geenin koosta riippuen, mutta lopulta toistuvilla PCR, suurin osa templaateista rajoittuu pelkästään kiinnostavan geenin kokoon, koska ne on tuotettu molempien geenien tuotteista. alukkeet.

Niitä on useita erilaisia onnistuneen PCR: n tekijät joita voidaan manipuloida tulosten parantamiseksi. Yleisimmin käytetty menetelmä PCR-tuotteen läsnäolon testaamiseksi on agaroosigeelielektroforeesi. Sitä käytetään DNA-fragmenttien erottamiseen koon ja varauksen perusteella. Sitten fragmentit visualisoidaan käyttämällä väriaineita tai radioisotooppeja.

PCR: n keksimisen jälkeen on löydetty muita DNA-polymeraaseja kuin alkuperäinen Taq. Joillakin näistä on parempi "oikoluku" tai ne ovat vakaampia korkeammissa lämpötiloissa, mikä parantaa PCR: n spesifisyyttä ja vähentää virheellisen dNTP: n lisäämisestä aiheutuvia virheitä.

Jotkut PCR: n muunnelmat on suunniteltu tiettyihin sovelluksiin, ja niitä käytetään nyt säännöllisesti molekyyligeneettisissä laboratorioissa. Jotkut näistä ovat reaaliaikainen PCR ja käänteistranskriptaasi PCR. PCR: n löytäminen on myös johtanut DNA-sekvensoinnin kehittämiseen, DNA-sormenjäljet ja muut molekyylitekniikat.